Western Blot 实验技术详解

## 实验原理 Western Blot 通过 SDS-PAGE 分离蛋白质，然后转移到膜上，用特异性抗体检测目标蛋白。 ## 实验步骤 ### 1. 蛋白提取 使用 RIPA 裂解液提取细胞总蛋白。 ### 2. SDS-PAGE 电泳 - 浓缩胶：5%，80V，30 分钟 - 分离胶：10-12%，120V，60-90 分钟 ### 3. 转膜 湿转法：100V，60-90 分钟（冰浴） ### 4. 封闭 5% 脱脂牛奶，室温 1 小时 ### 5. 一抗孵育 4°C 过夜 ### 6. 二抗孵育 室温 1 小时 ### 7. 显色 ECL 化学发光法检测 ## 常见问题 - 背景过高：优化封闭条件 - 无信号：检查抗体效价 - 非特异性条带：优化抗体浓度